在蛋白质印迹中使用二抗的一般建议

1.控制

为了区分样品材料的特异性和非特异性条带，请始终对每个印迹进行对照，其中仅应用二抗偶联物，而无一抗。

2.二抗稀释

二抗不要以太高的浓度使用，因为这会促进非特异性背景结合的发展。在大多数应用中，二抗的稀释度可超过1：10,000，ECL甚至是使用有色底物时的两倍。最佳稀释度在批次之间也有所不同。

推荐的Western Blot稀释液：

HRPO共轭物：1：5,000-1：100,000（无ECL）/ 1：10,000-1：200,000（ECL）
碱性磷酸酯
共轭物：1：5,000-1：50,000生物素共轭物：1：20,000-1： 400,000
链霉亲和素-HRPO：0.01-0.1μg / ml
链霉亲和素-Alk.Phos。：1-2微克/毫升

3.使用牛乳粉时要小心

牛乳粉通常用于阻止印迹。有时这也可能是不需要的背景的来源。
为了避免二抗与奶粉中牛Ig的背景反应，通常有利的是使用已吸附抗牛（MinX Bo）或人（MinX Hu）Ig /血清蛋白的二抗。

减少非特异性背景的其他措施是使用与二抗 相同物种的5％正常血清进行封闭， 或使用 不含IgG的BSA  （目录号001-000-161 / 2）进行封闭。对于有问题的污点，以简单的方法封闭正常血清通常可以得到最干净的结果。

通常，仅应在不含添加蛋白质的缓冲液中稀释第二抗体，例如奶粉等，以排除第二抗体与添加蛋白质中的蛋白质或免疫球蛋白的反应。对于抗山羊偶联物尤其如此（请参见4.）。

4.使用抗山羊偶联物时要小心

来自驴，兔和小鼠宿主物种的抗山羊二抗与牛免疫球蛋白例如 B.在奶粉中交叉。如果奶粉包含在第二抗体稀释缓冲液中，则抗山羊偶联物可能已经被牛Ig“吸附”在稀释缓冲液中。缀合物完全不传递信号，或者仅以非常高的浓度传递信号。另外，如果使用牛乳粉进行封闭，则这些结合物的印迹可能会有背景。

因此，我们建议使用牛抗山羊 （目录号805-xx5-180）来检测Western印迹中的山羊一抗 。由于二抗是在与牛密切相关的物种中产生的，因此它与牛的Ig /血清蛋白没有交叉反应。

5.样品裂解物中的内源性免疫球蛋白

如果通过凝胶分离的样品是含有免疫球蛋白的细胞或组织的裂解物，则应使用与样品组织来源的物种没有交叉反应（MinX）的二抗。（或者，可以将与样品材料来源相同的物种的正常血清（Ig）添加到第二抗体的稀释缓冲液中。）

6.免疫沉淀后的抗体背景带

您可以在以下内容中阅读以下内容：在间接检测二级抗体的情况下，如何避免由沉淀的免疫球蛋白引起的背景条带。

Immunoblot（Western Blot）-避免抗体背景带

使用二抗间接检测的免疫印迹（Western blot）中最常见的问题之一是背景条带，这是由于分离样品中的抗体（例如 B.通过事先的免疫沉淀，通过细胞或组织在裂解物中具有自身的免疫球蛋白，或通过污染牛免疫球蛋白（细胞裂解物中的FCS，BSA等）。在还原SDS-PAGE凝胶中，从样品洗脱的抗体的重链和轻链形成50 kDa和25 kDa的条带。在非还原条件下，γ免疫球蛋白（IgG）形成一条约150 kDa的条带。

最重要的是， 应该在免疫沉淀（IP）中解决此问题，尤其是当目标蛋白带预计在这些分子量范围内时。

通过使用直接标记的第一抗体来检测印迹上的目标蛋白，可以完全避免IP中抗体背景条带的问题。但是，通常没有一级抗体偶联物可用，因此未偶联的一级抗体必须用二级抗体偶联物标记。

避免用于IP的抗体出现不需要的条带的一种可能性是使抗体在蛋白A / G珠上交联或将其直接共价偶联至预处理的珠上。但是，为了避免用此方法污染抗体，至关重要的是在非变性条件下洗脱抗原，否则变性的抗体片段将被抗原洗脱。

如果使用未偶联的第一抗体和第二 抗体偶联物在印迹上检测到抗原，则可以通过选择第二抗体在某些条件下绕过抗体条带：

用于沉淀和检测的主要抗体：

1.来自不同的寄主物种。

印迹上沉淀抗体的背景条带可以被与沉淀抗体种类没有交叉反应（MinX）的二抗所排除。

实例：用多克隆兔抗靶蛋白沉淀，用单克隆小鼠抗靶蛋白
> 二级抗体抗小鼠IgG（H + L）MinX兔等（例如，目录号115-035-146）进行印迹检测。

抗IgG / M（H + L）且无物种交叉反应（MinX）的Western印迹

有更多的抗Ig（H + L），用于蛋白质印迹下特异性抗体： 二次抗体

2.来自相同的寄主物种

一种。具有不同的同种型。
通过选择对检测一级抗体亚类具有特异性的二级抗体，沉淀抗体在印迹上不会被识别。

实施例：用单克隆小鼠（IgG1）抗靶蛋白沉淀，用单克隆小鼠（IgG2a）抗靶蛋白进行印迹检测
> 二级抗体抗小鼠IgG2a（例如，目录号115-035-206）。

抗IgG亚类和抗IgM特异性二抗，用于蛋白质印迹

b。目标蛋白为50 kDa。
二次 抗体抗小鼠Ig / G的轻链都没有在印迹反应 与沉淀抗体的还原和变性的重链（50 kDa）的。它们仅与沉淀的抗体的还原的变性轻链结合（参见图），与检测抗体的天然轻链结合。仅在轻链区域检测到抗体条带，但在目标蛋白区域未检测到。

例子：目标蛋白约50 kDa；用单克隆小鼠（IgG1）抗靶蛋白进行沉淀，用单克隆小鼠（IgG1）抗靶蛋白进行印迹检测
> 二级抗体抗小鼠Ig / G轻链（例如，目录号115-035-174）。

C。目标蛋白为25 kDa。
次级 抗体针对小鼠IgG的重链做的Fc片段不发生反应 的抗体的还原和变性的轻链（25kDa的）。它们仅结合沉淀的抗体的还原，变性的重链和天然检测抗体的重链。抗体条带仅在重链区域标记，而在目标蛋白区域则没有标记。
抗IgG Fc特异性二抗也不能识别任何IgM或Ig类。

实例：目标蛋白约25 kDa；用单克隆小鼠（IgG1）抗靶蛋白进行沉淀，用单克隆小鼠（IgG1）抗靶蛋白进行印迹检测
> 二级抗体抗小鼠IgG Fc（例如，目录号115-035-071）。

抗IgG Fc特异的二抗Western blot

注意： 如果检测的一抗也以非还原形式识别其靶蛋白，并且如果可以在SDS-PAGE中以靶蛋白的大小显示靶蛋白，则可以在不使用还原剂的情况下使用样品。然后用于沉淀的一抗仅形成150 kDa的抗体条带，这不会干扰该分子量范围之外的目标蛋白的检测。

抗IgG轻链特异性抗体

抗IgG轻链特异性抗体与天然一抗反应，用于在Western印迹中检测蛋白质。 适当稀释后，它们不会在印迹中与IgG分子的还原和变性重链（50 kDa）反应。因此，如果样品来自免疫沉淀试验（IP），其中变性的重IgG链可以覆盖目标蛋白，则该抗体非常适合检测50 kDa的抗原。

尽管Western印迹中的抗轻链特异性抗体显示出与天然IgG轻链的强反应性，但是检测到还原形式和变性形式会导致灵敏度降低。因此，我们建议不要在Western blots中将抗体用于敏感/定量检测轻IgG链。

为了防止与印迹中也可能存在的免疫球蛋白发生交叉反应，吸附了来自许多物种的针对血清蛋白的抗体。

dianova-抗IgG轻链特异性MinX二抗-WB

免疫沉淀后，最好用抗IgG Fc片段特异性抗体检测25 kDa的靶蛋白，且在此分子量范围内无信号重叠，因为它们不会与抗体的还原和变性轻链反应。

插图：

图1。泳道1、2：检测在山羊中针对50 kDa靶蛋白的一抗；泳道3、4：检测通过SDS-PAGE分离的还原和SDS变性山羊IgG的重链（50 kDa）和轻链（25 kDa）；泳道5、6：还原的和SDS变性的小鼠IgG（对照）。

图2。1-3道：还原的和SDS变性的小鼠IgG（对照）；泳道4-8：检测通过SDS-PAGE分离的还原和SDS变性山羊IgG的重链（50 kDa）和轻链（25 kDa）。
泳道3、4（图1）和泳道4-8（图2）证明了抗山羊轻链特异性抗体具有还原的和SDS变性的轻链的相对较弱的反应性。

（作者：Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.）

免疫印迹的荧光抗体

•与LI-COR®Odyssey兼容
•定量Western印迹
•凝胶内Western印迹
•细胞内和细胞内Western阵列
•最高的灵敏度和特异性

的AlexaFluor®680和AlexaFluor®790
的AlexaFluor®680是一个发光染料在黑暗中红色光谱（λ最大：684nm / 702nm的Emax）和Alexa 790Fluor®是红外荧光染料（λ最大：783纳米/ 803的Emax纳米）。

与抗体偶联的深红色和红外染料比传统的荧光染料更敏感，因为它们具有较低的猝灭作用，较高的消光系数和较低的自发荧光背景。明显更高的亮度允许在多种基于荧光的方法中使用。这些方法包括高度敏感的蛋白质印迹，定量蛋白质印迹，凝胶内蛋白质印迹，微型蛋白质芯片，细胞内和细胞内蛋白质芯片，组织切片成像，全身成像方法以及其他需要高发光度的方法。

AlexaFluor®680和AlexaFluor®790用于暗红色（远红色）和红外（红外）检测

图1：使用AlexaFluor®680（深红色）和AlexaFluor®790（红外）偶联的二抗（稀释度1：100,000）进行的双重免疫荧光Western印迹。用β-巯基乙醇还原小鼠（泳道1）和山羊IgG（泳道2），在变性条件下在SDS凝胶上分离，然后在硝酸纤维素膜上吸干。然后将重链与790山羊抗小鼠IgG，Fc-γ亚类1特异性抗体（不与人，牛和兔的血清蛋白发生交叉反应）偶联（绿色，目录号115-655-205）和使用AlexaFluor®680偶联的山羊抗小鼠IgG轻链特异性抗体对轻链进行检测，该抗体吸附了来自牛，山羊，马，人，兔，大鼠和绵羊（红色）的血清蛋白（LiCor Odyssey Imager）。山羊IgG用作背景对照。请注意，由于染料的极高亮度，即使以1：100,000的比例稀释，仍然可以看到山羊IgG重链和轻链的弱条带（图。Jackson ImmunoResearch）。

AlexaFluor®680和AlexaFluor®790的特性

Jackson ImmunoResearch提供了多种AlexaFluor®680和AlexaFluor®790偶联信号增强抗生物素，抗FITC和抗HRPO抗体，亲和纯化的二抗，链霉亲和素偶联物和IgG对照，可用于单和双Westerns印迹染色。二抗吸附于其他物种和类别的免疫球蛋白，以确保无交叉反应的双重标记（图1）。

两种染料均可与LiCor Odyssey系统以及上面列出的所有高度敏感的方法一起使用。由于极高的敏感性，我们建议以1：50,000至1：200,000的稀释度使用抗体。