小鼠组织中小鼠抗体的免疫组织化学染色

高背景染色通常使间接检测小鼠组织中的小鼠一抗更为困难。主要问题是抗小鼠二抗无法通过间接检测方法区分样品组织中的内源性小鼠免疫球蛋白和小鼠一抗。

内源性免疫球蛋白主要以可溶形式分布在细胞间空间中，并且尤其在检测位于细胞表面附近或细胞外基质中的抗原时引起问题。

另外，在淋巴细胞的细胞表面上发现了组织特异性免疫球蛋白。背景水平取决于组织的类型，并且随样品的不同而不同。该问题通常发生在由肌肉，皮肤和肾脏组成的组织中。

内源性免疫球蛋白不是小鼠鼠标染色中背景增加的唯一原因。

样品组织或Fc受体中的内源性过氧化物酶活性也可能会产生影响，在正常血清封闭之前或在一次抗体孵育后，可以通过封闭步骤抑制过氧化物酶活性。

一方面，可以通过用正常血清或特殊的Fc受体封闭溶液进行适当的封闭来防止第二抗体与细胞和组织的Fc受体结合。如果将Fab（2）片段用作二抗，则完全排除了与Fc受体的结合。

用Fab片段阻断内源性免疫球蛋白
 

 

在间接检测方法中，防止内源性免疫球蛋白的背景染色的一种特别有效的方法是将样品组织与未缀合的抗小鼠抗体的Fab片段预孵育。此方法可以轻松地转移到同源组织和细胞上其他物种的一抗的间接检测（免疫组织化学，免疫荧光，细胞计数）。
 

小鼠抗体在大鼠组织上的免疫组织化学染色

由于小鼠和大鼠之间的高度同源性，抗小鼠IgG的二抗与大鼠IgG交叉反应，因此会在样品组织中引起内源性大鼠免疫球蛋白的不良背景标记。

内源性免疫球蛋白位于细胞间空间中，尤其在检测位于细胞表面附近或细胞外基质中的抗原时会引起问题。背景的高度取决于组织类型和单个样本。该问题通常发生在由肌肉，皮肤和肾脏组成的组织中。

这里可以找到一种在间接检测小鼠组织中的小鼠抗体时防止内源性免疫球蛋白背景染色的方法 。

防止组织特异性免疫球蛋白对背景进行染色的更简单方法是选择二抗，使对与一抗宿主物种同源的物种的交叉反应性最小（MinX）。
在大鼠组织上标记小鼠一抗时，需要抗小鼠MinX大鼠二抗  。

 遵循示例协议，在大鼠组织上染色 ，步骤7./8。省略，然后在步骤11中。B.猫号 115-035-166。注：由于与紧密相关物种的吸附，有时不再识别具有较少常见IgG亚类（IgG2b，IgG3）的单克隆一抗。吸附的针对同种Ig的二抗的敏感性降低。这尤其适用于抗小鼠（对大鼠吸附），抗大鼠（对小鼠吸附）或抗（差）仓鼠（对小鼠，大鼠吸附）。

如果不是绝对有必要在另一种紧密相关的物种（例如大鼠）的存在下检测一种物种（例如小鼠）的一抗，则应避免选择吸附有紧密相关物种的第二抗体。